空間エピゲノム

Nature volume 616、pages 113–122 (2023)この記事を引用

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294 オルトメトリック

メトリクスの詳細

空間トランスクリプトミクスや空間エピゲノミクスなどの新しい空間技術は、組織の状況における細胞状態のプロファイリングのための強力なツールになりつつあります1、2、3、4、5。 しかし、現在の方法では、一度にオミクス情報の 1 層しか取得できないため、分子生物学のセントラル ドグマ全体にわたる機構の関係を調べる可能性が妨げられています。 ここでは、クロマチンのアクセス可能性と遺伝子発現、またはヒストン修飾（H3K27me3、H3K27ac、または H3K4me3）と遺伝子発現をほぼ同一の組織切片上で配列決定することにより、エピゲノムとトランスクリプトームを空間的に分解してゲノム全体に統合プロファイリングするための 2 つの技術を紹介します。単一細胞の解像度。 これらは、エピジェネティックなメカニズムが組織内の転写表現型と細胞の動態をどのように制御するかをマッピングするために、胎児および幼若マウスの脳、さらに成人のヒトの脳に適用されました。 高度に一致する組織特徴が空間エピゲノムまたは空間トランスクリプトームのいずれかによって特定されましたが、異なるパターンも観察され、細胞状態の定義におけるそれらの異なる役割が示唆されました。 エピゲノムとトランスクリプトームをピクセルごとにリンクすることで、組織構造内の空間的エピジェネティックなプライミング、分化、および遺伝子制御に関する新たな洞察を明らかにすることができます。 これらのテクノロジーは、生命科学および生物医学研究において大きな関心を集めています。

単細胞マルチオミクスにより、さまざまなオミクス層にわたる遺伝子制御のメカニズムを明らかにすることができます6、7、8、9が、組織内の細胞機能を理解するために重要な空間情報が不足しています。 空間エピゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスは最近登場しました 1、2、3、4、5 が、これらのほとんどはオミクス情報の 1 層しかキャプチャできません。 計算手法は複数のオミクスからのデータを統合できますが 10、異なるオミクス層間の機構的なつながりを容易に明らかにすることはできません。 以前、私たちはトランスクリプトームとタンパク質のパネルを空間的に分解して測定するための空間オミックスシークエンシングのための組織内の決定論的バーコーディングを開発しました11。そして最近、それは10X Visiumプラットフォームでも実現されました11。 ここでは、遺伝子発現制御の根底にあるエピジェネティックなメカニズムをさらに調査するために、クロマチンのアクセス可能性とメッセンジャーRNA発現の同時プロファイリングによるエピゲノムとトランスクリプトームの空間的に分解されたゲノムワイドのコンマッピングを開発しました（シーケンシングを使用したトランスポザーゼにアクセス可能なクロマチンとRNAの空間アッセイ（空間ATAC–RNA-seq））、またはヒストン修飾とmRNA発現（シーケンシングを使用したターゲットおよびタグメンテーションおよびRNAの空間アッセイ（空間CUT&Tag–RNA-seq）; H3K27me3、H3K27acまたはH3K4me3ヒストン修飾に適用）決定論的なコバーコーディングを介して細胞レベルで組織切片を作成し、spatial-ATAC-seq3 または spatial-CUT&Tag2 の化学を空間トランスクリプトミクスの化学と統合します。 我々は、これらの技術を胎児および幼若マウスの脳、さらに成人のヒトの脳の海馬に適用して、エピジェネティックな状態と転写状態、および組織内の細胞型動態の制御におけるそれらの役割を詳しく分析しました。 この研究は空間オミクスの新たな境地を開き、生物学および生物医学研究に前例のない機会を提供する可能性があります。

空間ATAC-RNA-seqを図1aおよび拡張データ図1a-cに概略的に示します。 凍結組織切片をホルムアルデヒドで固定し、トランスポザーゼがアクセス可能なゲノム DNA 遺伝子座に挿入できるユニバーサル ライゲーション リンカーを含む DNA アダプターをあらかじめロードした Tn5 転移複合体で処理しました。 次に、同じ組織切片を、ユニバーサルライゲーションリンカーと、mRNA のポリ A トレイルに結合して組織内で逆転写 (RT) を開始するポリ T 配列を含むビオチン化 DNA アダプターとともにインキュベートしました。 次に、マイクロ流体チャネルアレイチップを組織切片上に配置し、テンプレートライゲーションを介してユニバーサルライゲーションリンカーに共有結合した空間バーコードAi（i = 1〜50または100）を導入しました。 次に、最初の流れ方向に垂直なマイクロチャネルを備えた別のマイクロチップを使用して空間バーコード Bj (j = 1−50 または 100) を導入し、それをバーコード Ai (i = 1−50 または 100) に連結しました。空間的にバーコード化された組織ピクセルの次元グリッド。バーコード Ai と Bj の一意の組み合わせによってそれぞれ定義されます (i = 1−50 または 100、j = 1−50 または 100、バーコード化ピクセル、n = 2,500 または 10,000)。 最後に、逆架橋後にバーコード化された相補 DNA およびゲノム DNA フラグメントが放出されました。 cDNA はストレプトアビジン ビーズで濃縮され、gDNA フラグメントは上清に保持されました。 gDNA と cDNA のライブラリは、次世代シーケンシング (NGS) 用に別々に構築されました。 空間 CUT&Tag – RNA-seq は、特定のヒストン修飾 (H3K27me3、H3K27ac または H3K4me3) に対する抗体を組織切片に適用し、プロテイン A 結合 Tn5-DNA 複合体を使用して CUT&Tag を実行することによって実行されました。 残りのステップは、空間ATAC-RNA-seqの場合と同様でしたが（図1aおよび拡張データ図1a、d、e）、ゲノム全体のヒストン修飾占有率とトランスクリプトームの空間的共プロファイリングが行われました。

a、概略的なワークフロー。 b、空間ATAC-RNA-seqおよび空間CUT&Tag-RNA-seqにおけるユニークなフラグメントの数とピーク内のリードの割合（FRiP）の比較。 c、空間ATAC-RNA-seqおよび空間CUT&Tag-RNA-seqにおける遺伝子およびUMI数の分布。 E13 のピクセル数、2,187。 人間の脳では2,500。 マウス脳内 (ATAC)、9,215; マウス脳内 (H3K27me3)、9,752。 マウス脳内 (H3K27ac)、9,370; マウス脳内 (H3K4me3)、9,548。 箱ひげ図は、中央値 (中心線)、第 1 四分位数と第 3 四分位数 (箱の限界)、および 1.5 倍の四分位範囲 (ひげ) を示します。 d. ATAC、RNA のすべてのクラスターの空間分布と UMAP、および ATAC データと RNA データの結合クラスタリング。 クラスターと組織画像を重ね合わせると、空間クラスターが解剖学的領域と正確に一致していることがわかります。 ピクセルサイズ、50μm。 スケールバー、1 mm。 e、空間ATAC-RNA-seqにおけるATACおよびRNAの異なるクラスター内の選択されたマーカー遺伝子のGASと遺伝子発現の空間マッピング。 f、空間レベルで視覚化された放射状グリアから有糸分裂後未熟ニューロンまでの擬時間分析。 g、遺伝子発現とマーカー遺伝子の GAS を示すヒートマップ。 h、擬似時間にわたる GAS および遺伝子発現の動的変化。

胎生13日（E13）のマウス胎芽（ピクセルサイズ、50μm）、マウス生後21/22日（P21/22）の脳（ピクセルサイズ、20μm）、および成人のヒト脳の海馬に対して空間ATAC-RNA-seq実験を実施しました。組織（ピクセルサイズ、50μm）。 ピクセル サイズ 50 μm の場合、E10 マウス胚 1 では平均 25 個の細胞、ヒト海馬 3 では 1 ～ 9 個の細胞が得られました。 ほとんどの20μmピクセルには、幼若マウスの脳のピクセルあたり1〜3個の細胞が含まれていました（補足図1b）。 100 × 100 のバーコード スキームを使用すると、マッピング領域は P22 マウスの脳冠状断面のほぼ半球全体をカバーします。 このサンプルから、ピクセルあたり14,284個の固有のフラグメントの中央値が得られ、そのうち19％が転写開始部位領域に富み、26％がピークに位置していました（図1bおよび補足図1aおよび2a）。 RNA部分では、合計22,914個の遺伝子が検出され、ピクセルあたり平均1,073個の遺伝子と2,358個の固有分子識別子（UMI）が検出されました（空間ATAC-RNA-seq）（図1c）。 マウス P21/22 脳 (ピクセル サイズ、20 μm) で H3K27me3、H3K27ac、および H3K4me3 の空間 CUT&Tag-RNA-seq を実行しました。 100 × 100 のバーコード デバイスでは、ピクセルあたり 10,644 (H3K27me3)、10,002 (H3K27ac)、2,507 (H3K4me3) の固有フラグメントの中央値が得られ、そのうち 12% (H3K27me3)、17% (H3K27ac)、67% (H3K4me3) でした。転写開始部位領域と重複し、12％（H3K27me3）、21％（H3K27ac）、および54％（H3K4me3）がそれぞれピークに位置しました（図1bおよび補足図1aおよび2a）。 RNA データの場合、25,881 (H3K27me3)、23,415 (H3K27ac)、22,731 (H3K4me3) の遺伝子が検出され、ピクセルあたり平均 2,011 (H3K27me3)、1,513 (H3K27ac)、1,329 (H3K4me3) の遺伝子 (4,734 (H3K2) 7me3)、3,580 (H3K27ac) と 1 ピクセルあたり 2,885 (H3K4me3) の UMI がそれぞれあります (図 1c))。 50×50のバーコードを備えたマウス胚、P21マウス脳、および人間の脳サンプルのデータ品質の評価も、図1b、c、補足図に含まれています。 1a および 2a ～ c​​ および補足表 2 および 3。

さらに、クロマチンアクセス可能性（空間ATAC-RNA-seq）およびヒストン修飾（空間CUT&Tag-RNA-seq、H3K27me3、H3K27acまたはH3K4me3）フラグメントの挿入サイズ分布は、すべての組織で捕捉されたヌクレオソームフラグメントと一致しました（補足図1c）。 、d）。 反復間の相関分析では、高い再現性が示されました（ATAC の場合は r = 0.98、空間 ATAC-RNA-seq の RNA は r = 0.98、CUT&Tag (H3K27ac) の場合は r = 0.96、空間 CUT&Tag-RNA-seq の RNA は r = 0.89; rはピアソン相関係数を示します;補足図2d、e）。 組織の種類、準備、品質はすべて分析指標 (方法) に影響を与える可能性があります。

E13 マウス胚の空間 ATAC-RNA-seq により、8 つの主要な ATAC クラスターと 14 の RNA クラスターが同定されました。これは、発生のこの段階では、クロマチンのアクセス可能性によって、転写プロファイルによって定義されるすべての細胞型を区別できない可能性があることを示唆しています。 これらのクラスターの空間分布は組織組織学と一致しています（図 1d の隣接組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色および拡張データ図 2a を参照）。 ATACデータでは、クラスターA3は、Six6を含む遺伝子座でクロマチンアクセス可能性が開いている胎児の眼野を表します（図1d（左）および図1e）。 クラスター A4 ～ A5 は、いくつかの発達中の内臓に関連しています。 クラスター A6 ～ A7 は中枢神経系 (CNS) をカバーします。 ATACの結果をベンチマークするために、特定の臓器内のピクセル単位でクロマチンアクセシビリティプロファイルを集計し、これらを臓器固有のENCODE E13.5 ATAC-seq参照データと比較しました（補足図3b）。 さらに、空間ATACデータから得られたピークもENCODE参照と一致しています（補足図3c）。 各クラスターの細胞型割り当てのために、空間ATACデータと単一細胞RNA-seq12データを統合しました（拡張データ図2c、d）。 予想どおり、放射状グリア（神経幹細胞/前駆細胞）は主に心室層で観察され、有糸分裂後未熟ニューロンや抑制性介在ニューロンなどの分化した細胞タイプが心室層から離れた領域に豊富にありました（拡張データ図2d）。

細胞型特異的マーカー遺伝子が個々のクラスターで同定され、その発現はクロマチンのアクセス可能性から推測され（図1eおよび拡張データ図2b、e）、遺伝子活性スコアによって予測されました（GAS13;方法）。 神経組織の発達と視神経形成に関与する Sox2 は 14,15 、胎児の眼野および神経幹/前駆細胞を含む脳室層で高いクロマチン接近性を示しました。 Pax6 は、クロマチンのアクセス可能性の同様の空間パターンを示しました。 ミエリン転写因子 1 様タンパク質をコードする Myt1l は、胎児の脳と神経管でより高い ATAC シグナルを提示しました 16。 Six6 は目の発達に関与する重要な遺伝子 17 で、目の領域で最も高い GAS を示しました。 脊椎動物の神経系の重要な遺伝子であるニューレキシン 2 をコードする Nrxn2 18 は、ほとんどの神経細胞領域で広範囲にアクセス可能でした。 RNA結合タンパク質fox-1ホモログ3（NeuNとして知られるスプライシング因子）19をコードするRbfox3でのアクセス性がニューロンで観察されました19が、Sox1およびSox2は心室層で豊富なクロマチンアクセス性を示しました（図1eおよび拡張データ図2b） ）。 転写因子（TF）調節因子の細胞型特異的濃縮も、TFモチーフ（Sox2およびNfix）の偏差のChromVAR20分析を使用して検査され、陽性のTF調節因子が特定されました（拡張データ図2g、h）。 我々は、Sox2 モチーフがクラスター A7 に豊富に存在することを観察しました。これは、胎児の脳の発達におけるその機能と一致しています 21。 優れた分析 22 により、遺伝子調節経路と解剖学的注釈との間の強い一致がさらに検証されました (拡張データ図 2i、j)。

RNA 空間データについては、14 の異なるクラスターが特定され、特定のマーカー遺伝子によって特徴付けられました (図 1d (中央) および拡張データ図 2f)。 たとえば、クラスター R10 (Six6) は胎児の目に関連し、クラスター R2、R6、および R8 は CNS に関連し、クラスター R7 は軟骨の形成に関連しました。 データの品質を評価するために、臓器固有のENCODE E13.5 RNA配列参照データとの相関分析を実行しました。これは、高い一致性を示しました（補足図3a）。 細胞型特異的マーカー遺伝子も個々の RNA クラスターで同定されました。たとえば、Mapt (R2) はニューロン極性の確立と維持に機能する可能性があります 23。 Epha5 (R6) は軸索誘導に関与し、一方 Slc1a3 (R8) は CNS18 における興奮性神経伝達の調節に関与します。 Myh3 (R3) は筋肉の収縮に関連しています24。 Col2a1 (R7) は軟骨組織で特異的な発現を示し、正常な胎児の骨格の発達に重要な役割を果たしています 18。 経路分析 25 の結果は、解剖学的注釈と一致します（補足図 4a）。

空間RNAデータとscRNA-seqマウス器官形成データ12の統合を実行して、各ピクセルの細胞の同一性を決定しました（拡張データ図2c、d）。 我々は、ATAC 解析 (クラスター A7 および A6) で示されたのと同じ主要なクラスターに、放射状グリア、有糸分裂後未熟ニューロン、および抑制性介在ニューロン (クラスター R8、R6、および R2) が存在することを観察しました。確実な細胞型識別。 空間パターンを改良するために、空間 ATAC データと RNA データの共同クラスタリングを試みました。 新しいニューロンクラスター（J10）が共同クラスター分析で特定されましたが、これは単一のモダリティだけでは簡単に解決できませんでした（図1d、右）。 この結果は、空間的な細胞タイプのマッピングを改善するためにジョイント マルチオミクス プロファイルを使用することの価値を強調しています 26。

エピゲノムとトランスクリプトームの同時プロファイリングにより、組織内でアクセス可能なピークと発現遺伝子の間の相関関係をピクセルごとに調査することが容易になります。 いくつかの遺伝子（Sox2、Pax6、およびSox1）の予測エンハンサーで明確なシグナルが観察されました（拡張データ図2eおよび補足図4b）。 たとえば、Sox2 および Pax6 のエンハンサーは、それぞれクラスター A7 および A3 においてクロマチンへのアクセス性が高く、これらの組織領域における Sox2 および Pax6 の発現制御における役割を示唆しています。 これらの遺伝子の空間的RNA分布はクロマチンのアクセス可能性と一致していましたが、発現レベルはアクセス可能性の程度とは大きく異なる可能性があります（図1eおよび拡張データ図2b）。 一部のマーカー遺伝子（Pax6、Sox2、およびMyt1l）は、胎児の脳の一部の領域で高度にアクセス可能でしたが、中程度または低いRNA発現を示しました（図1eおよび拡張データ図2b）。これは、これらの遺伝子の系統プライミングを示している可能性があります10,27。胎児の脳の発達。 複製間の強い相関関係にもかかわらず（補足図2d）、この観察は部分的にはシーケンシングの深さとRNA検出感度によるものである可能性があります。 それにもかかわらず、これらの結果は、ゲノム全体にわたるエピジェネティックな調節が空間的組織状況における転写に結び付けられる可能性を依然として強調している。

胚発生におけるクロマチンのアクセス可能性と遺伝子発現の時空間的関係を調べるために、我々は放射状グリアから有糸分裂終了未熟ニューロンなどのさまざまな種類のニューロンへの分化軌跡を分析しました28。 擬似時間分析29はATAC擬似時間座標系の下で実施され、発達の軌跡は空間組織マップで直接視覚化されました（図1f）。 クロマチンアクセシビリティGASおよびこの軌跡に沿った遺伝子発現は、選択されたマーカー遺伝子の動的な変化を示しました（図1g、h）。 予想どおり、Sox2、Pax6、および前駆細胞の維持と増殖に関与するその他の遺伝子（拡張データ図3aのジーンオントロジー（GO）Fabp7からPax6）の発現レベルは、有糸分裂後ニューロンへの移行中に下方制御されました。 Pax6および放射状グリアマーカーFabp7遺伝子座でのクロマチンアクセス性の喪失は、対応するRNAの下方制御に先行しました（図1h）。 次に、Dcx や Tubb3 などのニューロンの同一性、軸索形成、シナプスの組織化に関与する遺伝子 (拡張データ図 3a の GO Myt11 から Dnm3) は、空間擬似時間で発現の増加を示しましたが、それらの遺伝子座でのクロマチンのアクセス可能性は初期の段階ですでに上昇していました。 、発現におけるこれらの遺伝子の系統プライミングを示唆しています10,27。 また、空間的擬似時間中に発現が急速に低下するが、クロマチンへのアクセス可能性が擬似時間を通して維持されるか、または非常に遅い段階でのみ低下する遺伝子のコホートも発見した。 Ptprz1、Bcan、Luzp2などのこれらの遺伝子の多くは希突起膠細胞前駆細胞の特徴であり、対応するGOの生物学的プロセスは髄鞘形成の負の制御とグリア新生の制御（拡張データ図3aのSparcl1に対するGO Cp）であり、これは次のことを示唆しています。ニューロン系統は、胎児の脳の脳室帯からすでに移動してしまった場合でも、希突起膠細胞のアイデンティティを獲得する可能性を保持している可能性があります。 Monocle2 擬似時間解析では、クロマチンへのアクセスの分岐が示されましたが、RNA 発現では分岐が示されませんでした。 1 つの経路は心室帯に近い領域 (緑のピクセル、拡張データ図 3d、e) につながり、もう 1 つの経路は心室帯から遠位の領域 (青のピクセル) で終了します。 緑色のパスとは対照的に、青色のパスでは、軸索形成および樹状突起形成に関与する遺伝子のクロマチンへのアクセス性の増加が示され（拡張データ図3e（赤いボックス）、3f）、心室遠位の神経細胞のクロマチン状態が変化していることを示唆しています。より分化したニューロンの状態に対応します。 したがって、私たちの空間 ATAC-RNA-seq は、組織発生中の遺伝子制御機構と時空間動態を解読するために使用できます。

我々は、100 × 100、つまり組織切片あたり合計 10,000 ピクセルとチップあたり最大 5 つのサンプルをバーコード化するための 100 本の蛇行マイクロチャネルを備えたマイクロチップを開発しました（図 2a、ピクセル サイズ 20 μm）。 これは、トランスクリプトームによるクロマチンのアクセス可能性の共同プロファイリングのために、P22 マウスの脳冠状切片 (ブレグマ 1 で) に適用されました。 E13 マウス胎児の脳とは対照的に、RNA クラスター (11) と比較して ATAC クラスター (14) の数が多く、未分化な細胞が多く含まれる胎児の脳と比較して、幼若脳ではほとんどの主要な細胞型が最終分化していることが示されました。または多能性細胞状態。 クラスターの空間分布は、ニッスル染色によって定義された解剖学的注釈と一致し、少年の脳の領域化を反映しています（図2b）。 さらに、ATACとRNAの間の空間クラスターは、クラスター割り当ての一致を示しました（補足図5a）。 マーカー遺伝子のクロマチンアクセス可能性により、線条体（Pde10aおよびAdcy5、中型有棘ニューロンのマーカー、クラスターA1）、脳梁（Sox10、MbpおよびTspan2、希突起膠細胞のマーカー、クラスターA3）、皮質（Mef2c、Neurod6およびNrn1）などの主要領域が同定された。 、クラスターA0およびA4、興奮性ニューロンのマーカー;Cux2、クラスターA4）および側脳室（Dlx1、Pax6、Notch1およびSox2、上衣/神経前駆細胞のマーカー、クラスターA11）（図2eおよび拡張データ図4a、 b）。 優れた分析により、主要な経路がさまざまな解剖学的領域の組織機能と相関していることが確認されました（補足図5b、c）。 空間的 RNA クラスターは、線条体 (Pde10a、クラスター R2、中型有棘ニューロン)、脳梁 (Mbp および Tspan2、クラスター R5、稀突起膠細胞)、および皮質 (Mef2c、クラスター R0 および R1、興奮性ニューロン) などの領域特異的な遺伝子発現も示しました。図 2e および拡張データ図 4a)。

a、チャネルサイズ20μmの100×100バーコード用のマイクロ流体チップの設計。 b、マウス脳の空間ATAC-RNA-seqにおけるATACおよびRNAのすべてのクラスターの空間分布とUMAP。 ピクセルサイズ、20μm。 スケールバー、1 mm。 c、マウス脳からのATACデータとscATAC-seqデータ30の統合。 d. マウス脳からの RNA データと scRNA-seq データ 32 の統合。 e、空間ATAC-RNA-seqにおけるATACおよびRNAの異なるクラスター内の選択されたマーカー遺伝子のGASと遺伝子発現の空間マッピング。 略語の定義のリストは、補足表 1 にあります。

単一細胞の ATAC-seq マウス脳アトラス データ 30 と空間 ATAC-seq データを統合することにより、すべての主要な細胞型の同定が容易になり、ラベル転写を使用して、エピジェネティックな状態が特定の細胞型の形成を制御する可能性がある空間的位置に細胞型を割り当てました (図 2c および拡張データ図 4c)。 例えば、脳梁に相当するクラスターA3では未熟希突起膠細胞と希突起膠細胞が観察されました。 放射状グリア様細胞の薄層が側脳室、中型有棘ニューロン（D1MSNおよびD2MSN）が線条体、および抑制性ニューロンが側中隔核に見出され、クロマチンのアクセス可能性に基づいて30（拡張データ図4c）。 さらに、皮質のさまざまな層の興奮性ニューロンのサブクラス（ITL23GL、皮質L2/3; ITL4GL、皮質L4; ITL5GL、皮質L5; PTGL、皮質PT; NPGL、皮質NP; ITL6GL、皮質L6; CTGL、皮質CT; L6bGL、Cortex L6b）が明確に識別されました31（拡張データ図4c）。 空間RNAデータと若年性CNS scRNA-seq atlas32の統合により、組織内の優勢な転写細胞タイプの視覚化が可能になりました（図2dおよび拡張データ図4d）。 我々は、ATAC 対 RNA によって決定される細胞型の空間分布に高度な一致を観察し、組織内の細胞のアイデンティティを定義する際のクロマチンのアクセス可能性とトランスクリプトームの間の一般的な一致を示唆しています。 例えば、神経中間前駆細胞 (SZNBL、scATAC-seq30 の放射状グリア様細胞に含まれる)、成熟希突起膠細胞 (MOL、scATAC-seq の希突起膠細胞に含まれる)、新しく形成された希突起膠細胞 (scATAC-seq の未熟希突起膠細胞に含まれる) RNAデータによって示された中型有棘ニューロン（MSN）は、ATACデータによって特定されたのと同じ領域に集中していました（拡張データ図4c、d）。 さらに、側脳室の SZNBL の薄層と、髄膜が保存されている領域の血管軟髄膜細胞 (VLMC) の検出により、単一細胞に近い解像度であっても、存在量の少ない細胞を識別する当社の技術の高い空間解像度が証明されました。 (VLMC の場合) (拡張データ図 4c、d)。

ATAC と RNA の共同プロファイリングにより、相関するピーク アクセシビリティと遺伝子発現を検索することで、遺伝子制御の状況を推測することが容易になります。 調節要素と標的遺伝子の間の21,417個の有意なピークと遺伝子の結合を検出しました（拡張データ図5c、d）。 動的に制御されたプロモーター相互作用を持ついくつかの潜在的なエンハンサーは、Dlx1 および Sox2 (クラスター A11)、Tspan2 (クラスター A3)、Adcy5 (クラスター A1) などの特定のクラスターに富んでいることがわかりました (拡張データ図 4b)。 ATAC–RNA-seq により、標的遺伝子の主要な制御領域を特定します。 TF モチーフ濃縮の空間パターン (Dnajc21、Pax6、Sox2、Sox4、および Mef2c) により、組織内で視覚化された TF 調節因子 33 についてのさらなる洞察が得られました (拡張データ図 5a、b)。 たとえば、Sox2 はクロマチンのアクセス可能性、遺伝子発現、推定上のエンハンサー、TF モチーフの濃縮について同時に検査され、遺伝子制御の動態をより包括的に理解できるようになりました。 胎児マウスの脳で観察されたように、オープンクロマチンアクセシビリティを持ついくつかのマーカー遺伝子（Sox10、Sox2、Neurod6、Pax6、およびNotch1）は発現しないか、または低発現でした（図2eおよび拡張データ図4a）。 P21 マウスの脳に対する生物学的反復実験も実行されました (拡張データ図 6; ピクセル サイズ 20 μm、バー​​コード 50 × 50)。 これらの遺伝子の多くは神経発達に関与する転写因子をコードしており、脳の発達におけるこれらの遺伝子の転写記憶ではなくエピジェネティックな記憶の可能性が示唆されています。

クロマチンのアクセス可能性に加えて、ヒストン修飾もエピジェネティックな制御の重要な側面です。 空間 CUT&Tag–RNA-seq を実行して、P22 マウス脳 (ピクセル サイズ 20 μm) のトランスクリプトームと H3K27me3 (抑制遺伝子座)、H3K27ac (活性化プロモーターおよび/またはエンハンサー)、または H3K4me3 (活性プロモーター) のヒストン修飾をそれぞれプロファイルします。 、100 × 100 バーコード）。 H3K27me3 と RNA については 13 個と 15 個の特異的なクラスター、H3K27ac と RNA については 12 個と 13 個のクラスター、H3K4me3 と RNA については 11 個と 12 個のクラスターをそれぞれ特定しました（図 3a-c）。 これらのクラスターはニッスル染色による解剖学的注釈と一致し、空間パターンにおける CUT&Tag と RNA との良好な一致を示しました（図 3a-c）。これは Belayer34 分析によってさらに確認されました（補足図 7c）。

a〜c、マウス脳におけるH3K27me3とRNA（a）、H3K27acとRNA（b）、H3K4me3とRNA（c）のすべてのクラスターの空間分布とUMAP。 ピクセルサイズ、20μm。 スケールバー、1 mm。 d、H3K27me3 データとマウス脳からの scCUT&Tag (H3K27me3) データ 37 の統合。 e、マウス脳からの H3K27ac データと scCUT&Tag (H3K27ac) データ 37 の統合。 f、空間 CUT&Tag (H3K27me3) – RNA-seq、空間 CUT&Tag (H3K27ac) – RNA-seq、および空間 CUT&Tag (H3K4me3) – RNA-seq とマウス脳の scRNA-seq データ 32 の RNA データの統合。

H3K27me3 については、クロマチン サイレンシング スコア (CSS2,35; Methods) の計算によって遺伝子発現を予測しました。 CSS が高い場合は、H3K27me3 の転写抑制機能により遺伝子発現が抑制されていることを示します。 H3K27ac および H3K4me3 の場合、活性遺伝子は高 GAS2,13 に対応する必要があります (方法)。 さまざまな修飾に基づく CSS または GAS のクラスター化により、すべての主要な組織領域が解決され（図 3a ～ c​​ および補足図 6）、領域特異的なマーカー遺伝子修飾が特定されました。 Cux2 はクラスター C9 (H3K27ac) およびクラスター C6 (H3K4me3) で高い GAS を示し、興奮性ニューロンの濃縮を示しました。 Cux2 は皮質の表層に相当する皮質層 2/3 で観察されました。 対照的に、H3K27me3は、同じ領域（クラスターC3）のCux2で枯渇しました（補足図6）。 Fezf2 (皮質層 5 のマーカー遺伝子) の GAS は、皮質のより深い層に対応するクラスター C8 (H3K27ac) およびクラスター C7 (H3K4me3) で高かった。 この層では、H3K27me3 (クラスター C1) の Fezf2 が枯渇しました。 Satb2 は、皮質層のクラスター C8 と C9 (H3K27ac)、および C6 と C7 (H3K4me3) で最も高い活性を示しましたが、クラスター C1 と C3 (H3K27me3) では最も低い CSS を示しました。 Tspan2は、クラスターC4（H3K27ac）およびクラスターC1（H3K4me3）で豊富でしたが、希突起膠細胞系統の発達に関連する脳梁のクラスターC5（H3K27me3）では減少しました（補足図6）。 対応するRNAクラスターも、皮質層2/3興奮性ニューロンのCux2（クラスターR5（H3K27me3ペア）、クラスターR5（H3K27acペア））によって例示されるように、一致する領域固有のサインを示しました（図3a〜cおよび補足図6）。およびクラスターR6（H3K4me3ペア））、皮質層5興奮性ニューロンのFezf2（クラスターR1（H3K27me3ペア）、クラスターR1（H3K27acペア）、クラスターR1（H3K4me3ペア））、脳梁の希突起膠細胞系列細胞のTspan2（クラスターR4） （H3K27me3ペア）、クラスターR4（H3K27acペア）およびクラスターR3（H3K4me3ペア）補足図6）。

空間 CUT&Tag データと scCUT&Tag データ 36,37 の統合と同時埋め込み (図 3d、e、および拡張データ図 7a) は、H3K27me3、H3K27ac、および H3K4me3 のデータにおけるエピジェネティックな状態が scCUT&Tag の対応する投影と一致することを示しました。 対応する若年性CNS scRNA-seq atlas32との統合により、転写細胞タイプをエピジェネティックなアイデンティティ/状態の空間的位置に割り当てるラベル転移が可能になりました（拡張データ図7g、h、下）。 例えば、我々は、脳梁内のMOL、側脳室の上衣細胞の薄層、大脳皮質の興奮性ニューロン、および線条体のMSNの濃縮を観察しました。 また、ペアのRNAデータをscRNA-seq atlas32と統合して、ラベル転移を介して優勢な転写細胞タイプを特定しました（図3fおよび拡張データ図7b–h）。 MOL、上衣細胞の薄層、MSN、および興奮性ニューロンは、CUT&Tag（H3K27acおよびH3K4me3）によって特定された同じ空間領域に濃縮されました（拡張データ図7g、h、上）。 特に空間 H3K27me3 では、scCUT&Tag との統合ではエピゲノム モダリティのいくつかのクラスター (クラスター C0、C1、および C3) の同一性を明確に示すことができませんでしたが、同じ組織切片からのペアの RNA データを使用した scRNA-seq データのラベル転移は明確に示されました。これらのクラスター内の細胞の同一性（図3a、dおよび拡張データ図7f）は、同じ組織切片内でCUT&TagとRNA-seq（空間CUT&Tag – RNA-seq）を組み合わせて細胞の種類または状態をより正確に識別する能力を強調しています。 。 ゲノム全体の遺伝子発現とすべてのクラスターにわたる対応するエンハンサー間の相互作用を直接推測するために、空間CUT＆Tag（H3K27ac）-RNA-seqから合計19,468個の重要なピークと遺伝子の連鎖を特定しました（補足図7a、b）。 P21 マウスの脳でも生物学的複製を実行しました (拡張データ図 8; ピクセル サイズ 20 μm、バー​​コード 50 × 50)。

ゲノムスケールでの遺伝子発現の空間的エピジェネティック制御をさらに理解するために、ATACおよびCUT&Tagから得られたGASまたはCSS（H3K27me3、H3K27ac、およびH3K4me3）を、P22マウス脳のすべての主要組織領域における対応するRNA発現と比較しました（図1）。図4a〜cおよび補足図9a、10a、および11a）。 たとえば、希突起膠細胞が豊富な脳梁では、H3K27me3とRNAの間に強い逆相関が観察されました（図4a）。 CSS が低く、RNA 発現が高い Mal、Mag、Car2 などの遺伝子は、髄鞘形成や稀突起膠細胞分化の制御などの GO 生物学的プロセスに対応します（拡張データ図 9a-c および補足図 8; GO は象限 IV 用）。 対照的に、CSSが高くRNA発現が低いGrin2bやSyt1などの遺伝子は、シナプス伝達や神経伝達物質放出などの神経プロセスに関連しています（拡張データ図9d、eおよび補足図8;象限IIのGO）。 これらの結果は、幼若脳における乏突起膠細胞分化の ATAC/H3K27me3/H3K27ac Nano-CUT&Tag 分析 37 と一致しており、このプロセス中に H3K27me3 抑制の 2 つの波が示されました 37。 また、乏突起膠細胞前駆細胞のマーカーである Ptprz1 など、脳梁内の H3K27me3 と RNA の両方のレベルが高い遺伝子の小さなサブセットも見つかりました（図 4a および補足図 8; 象限 I の GO）。データ図9g)、これはこれらの遺伝子のいくつかの転写の安定を示している可能性があります。 これは、脳梁内の希突起膠細胞前駆細胞 (Ptprz1 を発現) と成熟希突起膠細胞 (Ptprz1 が抑制されている) の両方が近接して存在することも部分的に原因である可能性があります。 線条体および表層および深層皮質層を含む、少年の脳の他の領域でもRNAとH3K27me3について同様の相関分析を実行しました（補足図9a、10a、および11a）。 また、領域特異的に活性化または抑制される神経細胞のプロセスに関与する遺伝子のコホートとの強い逆相関も観察されました。 たとえば、表皮質層では、シナプス伝達のGABA作動性調節の遺伝子はH3K27me3に富んでいましたが、グルタミン酸作動性シナプス伝達遺伝子の発現は高く、H3K27me3は低かった（補足図9b、10b、および11b;線条体、表層および深部皮質層のGO） ）。 脳梁とは対照的に、これらの領域では、H3K27me3 と RNA の両方に対して陽性の限られた数の遺伝子のみが見つかりました。 RNA発現とH3K27me3沈着との間には一般的な逆相関があるにもかかわらず、地域的な差異も観察されました（図4dの青陰の列）。 Nav3 と Sncb は、皮質と線条体の両方で低レベルの H3K27me3 を伴い、前者では発現されましたが、後者では発現されませんでした（拡張データ図 9h）。 Ablim2 や Gng7 などの遺伝子では逆のパターンが観察されました (拡張データ図 9h)。 乏突起膠細胞で発現され、脳梁に豊富に存在するマーカー遺伝子であるCar2は、脳梁や驚くべきことに線条体とは対照的に、皮質層にH3K27me3の占有を示した（拡張データ図9c）。 したがって、ポリコームを介した H3K27me3 沈着以外のメカニズムが、CNS のさまざまな領域におけるこれらの遺伝子の転写抑制に関与している可能性があります。

a〜c、脳梁におけるH3K27me3 CSSとRNA遺伝子発現（a）、H3K27ac GASとRNA遺伝子発現（b）、およびH3K4me3 GASとRNA遺伝子発現（c）の相関。 d、線条体および皮質深層および表層におけるH3K27me3 CSSおよびRNA遺伝子発現のアップセットプロット。 –、CSS または遺伝子発現が低い。 +、CSS または遺伝子発現が高い。 e、一般的な RNA マーカー遺伝子を使用した脳梁内のさまざまなヒストン修飾に対する高 (+) または低 (-) CSS/GAS を示すベン図。

ソースデータ

H3K27me3とは対照的に、脳梁内のRNAと活性化マークH3K4me3またはH3K27acとの間に強い相関関係が観察され、オリゴデンドログリアのプロセスを制御するこれら2つの様式で遺伝子が高度に発現され、沈着が高かった（図4b、cおよび補足図12）。 ; H3K27ac 象限 I および H3K4me3 象限 I) に進みます。 例えば、Malは、ATAC、H3K27ac、H3K4me3およびペアRNAに関して脳梁において最も高い活性または発現を示しました（拡張データ図9a）。 ＭＳＮのマーカー遺伝子であるＧｐｒ８８は、ＡＴＡＣ、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３については線条体に豊富であったが、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３については線条体におけるＣＳＳが低かった（拡張データ図９ｆ）。 さらに、脳梁におけるさまざまなヒストン修飾間の集合的調節を調べました（図4eおよび補足図13および14）。 一般に、H3K4me3とH3K27acは高い相関を示し、それらのシグナルはH3K27me3と逆相関しました（図4e）。 また、この組織領域のいくつかの遺伝子座におけるH3K4me3またはH3K27acとH3K27me3の共占有も観察しました（図4eおよび補足図13および14）。 これらの遺伝子は、希突起膠細胞の分化と髄鞘形成、およびタンパク質の異化と局在化などの他のプロセスに関与しています（補足図13および14）。 Ptprz1やFnbp1などのこれらの遺伝子のいくつかも、より高いレベルのH3K27me3とRNAを示しました（図4a）。 上で述べたように、この潜在的な H3K4me3/H3K27me3 二価性は転写のポイズニングを反映している可能性があります。

我々は、成人（31 歳男性）のヒト脳海馬形成に対して空間 ATAC-RNA-seq を実行しました。海馬は、認知機能や大うつ病 40 やアルツハイマー病 41 などの疾患に関与する複雑な脳領域です。 ATAC と RNA についてそれぞれ 7 つと 8 つの主要クラスターを特定し、その空間パターンは、特定のマーカー遺伝子 (図 5d) を含む主要な解剖学的ランドマーク (図 5a) と一致しました (図 5d)。 ATACクラスターA4は顆粒細胞層（GCL）（THY1、BCL11B）を表し、クラスターA6は脈絡叢に対応します（図5a、d）。 TF モチーフ (NEUROD1 および SNAI1) とその空間パターンがさまざまな組織領域で視覚化され、正の TF 調節因子が同定されました (拡張データ図 10b、c)。 RNAデータについては、クラスターR4（GCL）に富むPROX1やBCL11Bなどの固有のマーカー遺伝子（図5a、d）を持つ個別のクラスターも検出しました。

a、ヒト海馬におけるATACおよびRNAに基づくすべてのクラスターの明視野画像、空間分布およびUMAP。 ML、分子層。 Pyr、錐体ニューロン。 ピクセルサイズ、50μm、スケールバー、1mm。 b. ATAC データとヒト海馬の scATAC-seq データ 42 の統合。 c. RNA データと人間の脳からの snRNA-seq データの統合 43。 d、ATACおよびRNAの異なるクラスターにおけるGASおよび選択されたマーカー遺伝子の遺伝子発現の空間マッピング。 オリゴ、希突起膠細胞。 アストロ、アストロサイト。 DG、歯状回。

また、ヒトの脳サンプルからのATACデータとscATAC-seqデータ42（図5b）、および成人の脳のsnRNA-seqデータとRNAデータ43の統合を実行して、優勢な細胞のアイデンティティと状態を示しました。 snRNA-seq43によって識別された細胞タイプは、ラベル転移によって各クラスターに割り当てられました（図5cおよび拡張データ図10a）。 顆粒細胞（GC）は GCL で検出され、アンモニア角（CA）ニューロンは CA3 ～ 4 領域に集中し、VLMC は他の領域とは対照的に脈絡叢で強く区別されました。

一般に、ATACとRNAは両方とも、この領域のすべての主要な組織特徴を容易に解決できますが、エピゲノムとトランスクリプトームの空間的配列決定は、単一のモダリティでは実現できない動的な遺伝子制御機構についての新たな洞察を提供する可能性があります。 たとえば、錐体ニューロンの運命選択中の顆粒ニューロンのアイデンティティを定義するシグネチャー遺伝子であるPROX1 44 は、確かにGCLで高度に発現されていますが、クロマチンへのアクセス性は控えめでした（図5d）。 これは、有糸分裂終了した成熟顆粒細胞における新しい PROX1 転写物の合成に対する需要が最小限であるため、活性な開いたクロマチン状態を維持する必要がないことに起因すると考えられます。

NGS1、2、3、4、45、46、47 またはイメージング 5、48 のいずれかに基づく空間オミクス技術 (空間エピゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクス) は、空間組織における遺伝子制御について新しく豊かな洞察を生み出す前例のない機会を提供します。コンテクスト。 ただし、遺伝子制御のメカニズムを包括的に理解するには、オミクス情報のさまざまな層を同時にプロファイリングする必要があります。 これは、解離した単一細胞で最初に実証されました 6、7、8、9 が、組織ではまだ直接実現されていません。 イメージングベースの DNA 逐次蛍光 in situ ハイブリダイゼーションと RNA 逐次蛍光 in situ ハイブリダイゼーションを組み合わせることで、標的遺伝子および選択されたゲノム遺伝子座の空間的クロマチンおよび遺伝子発現が検出されました 49。 現在のところ、現在の技術では、同じ組織切片上のエピゲノムとトランスクリプトームを細胞レベルで公平にゲノム規模でコンマッピングすることはできていません。 私たちは、同じ組織切片上の全トランスクリプトームと組み合わせて、ゲノム全体のクロマチンへのアクセス性またはヒストン修飾を同時プロファイリングするために、空間 ATAC-RNA-seq および空間 CUT&Tag-RNA-seq (H3K27me3、H3K27ac、および H3K4me3 に適用) を開発しました。シングルセル解像度 (空間ブラウジングに利用可能。「データの利用可能性」を参照)。 これらの技術は、ヒトの成人の脳だけでなく、胎児および幼若マウスの脳の比較にも適用されました。 空間エピゲノム – トランスクリプトーム コシーケンスにより、組織内に 2 層の空間オミクス情報が直接得られ、データ品質は以前に単一モダリティで得られたものと同様でした。 これらの技術により、組織の状況における時空間ダイナミクスとゲノム全体の遺伝子制御メカニズムを調べることができます。

私たちは、ATAC または CUT&Tag を RNA と組み合わせて空間マルチオミクス マッピングを行うことを実証しました。 クロマチンのアクセス可能性、ヒストン修飾、トランスクリプトームの 3 つすべてを組み合わせて、組織内の遺伝子制御ネットワークのより包括的な状況を描写することが可能かもしれません。 また、複数のヒストン修飾を同時に測定して、空間遺伝子発現制御に対する多価効果を評価することも可能かもしれません。 以前、我々はトランスクリプトームとタンパク質の大規模なパネルの空間プロファイリングを実証しました1。 私たちは、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム 50 をさらに組み合わせて、細胞の種類、状態、遺伝子制御の空間パターンを分析することが可能であり、非常に価値があると考えています。 最後に、本明細書で報告する空間マルチオミクスは、神経科学や発生生物学を超えて広範囲に応用できる可能性がある。 たとえば、ヒトの疾患組織の空間マッピングのための複数のモダリティは、相互検証するだけでなく、単一モダリティの方法では容易に識別できなかった異常な細胞状態を引き起こすメカニズムをよりよく解明することもできます。 さらに、空間情報は、局所的な組織環境がセントラルドグマのすべての層にわたる細胞の状態、動態、および機能にどのような影響を与えるかをさらに示す可能性があります。 この研究では、100 × 100 のバーコード (合計 10,000 ピクセル、ピクセル サイズ 20 μm) を使用して、体のほぼ半球全体をカバーする、4 倍大きい組織領域のマッピングを可能にする、より大きなマッピング領域とより高いスループットを備えたデバイスを開発しました。幼若P22マウスの脳冠状切片。 蛇行チャネル設計により、それぞれ 10,000 ピクセルにマッピングされた 5 つの組織サンプルを同時に処理できます。 バーコードの数を増やすことでマッピング領域をさらに増やし、自動液体ハンドリングを使用してスループットをさらに向上させることが可能です。

要約すると、細胞レベルでのエピゲノムとトランスクリプトームの空間的に分解されたゲノム規模のコシーケンスは、空間生物学において最も有益なツールの 1 つであり、幅広い生物学および生物医学研究に適用できます。

マウス C57 胚矢状凍結切片 (番号 MF-104-13-C57) を Zyagen から購入しました。 新たに採取した E13 マウス胚を最適切断温度化合物中でスナップ凍結し、7 ～ 10 μm の厚さに切片化しました。 組織切片を、ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドガラス(Electron Microscopy Sciences、no. 63478-AS)上に収集した。

幼若マウス脳組織 (P21-P22) は、カロリンスカ研究所で維持されている C57BL/6xCD1 混合遺伝的背景上の Sox10:Cre-RCE:LoxP 強化緑色蛍光タンパク質 (eGFP) 系統から得られました。 この系統は、Ｓｏｘ１０：Ｃｒｅ動物（ジャクソン研究所、番号０２５８０７）とＲＣＥ：ｌｏｘＰ（ｅＧＦＰ）動物（ジャクソン研究所、番号０３２０３７－ＪＡＸ）とを交配することによって最初に生成された。 これは、Cre 対立遺伝子を欠く雄と半接合の Cre 対立遺伝子を持つ雌を交配することによって確立され、維持されました。 レポーター対立遺伝子は、男性と女性の両方でホモ接合性またはヘミ接合性で維持されました。 これにより、希突起膠細胞系統が eGFP で特異的に標識されます。 すべての動物には、マウスの細菌性およびウイルス性の病原体、外部寄生虫および内部寄生虫が存在しませんでした。 マウスでは次の明暗サイクルが維持されました：夜明け、06:00～07:00。 日中、07:00～18:00。 夕暮れ、18:00～19:00 夜、19:00〜06:00。 マウスは、個別に換気されたケージ内で、ケージ当たり最大５匹で飼育された（ＩＶＣ ｓｅａｌｓａｆｅ ＧＭ５００、テクニプラスト）。 温度、換気、相対湿度などの一般的な住宅パラメータは、実験およびその他の科学的目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に従っています。 空気の質は、高効率の微粒子エアフィルターを備えたスタンドアロンの空気処理ユニットを使用して制御されました。 相対空気湿度は、温度 22 °C で一貫して 55 ± 10% でした。 飼育パラメータは、ScanClime (Scanbur) ユニットで監視されました。 ケージには、硬材の寝具 (TAPVEI) の上に置かれた、カードボックスのシェルター、かじる棒、および巣材 (Scanbur) が含まれていました。 マウスには通常の固形飼料を与え、水はウォーターボトルで供給し、毎週交換した。 層流キャビネット内でケージを 2 週間ごとに交換しました。

P21/P22 でマウスをケタミン (120 mg kg-1 体重) とキシラジン (14 mg kg-1 体重) で麻酔し、その後冷酸素人工脳脊髄液で経頭蓋灌流によって屠殺した (87 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、75 mM スクロース、20 mM グルコース、1 mM CaCl2 * 2H2O および 2 mM MgSO4 * 7H2O (蒸留水中)。 分離後、Tissue-Tek OCT コンパウンド (Sakura) に包埋し、ドライアイスとエタノールの混合物を使用して瞬間凍結するまで、脳を人工脳脊髄液中で最小限の期間維持しました。 10 μm の冠状凍結切片を、ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドガラス (番号 63478-AS、電子顕微鏡科学) または 2 × 3 平方インチのスライドガラス (AtlasXomics) にマウントしました。

すべての実験手順は欧州指令に従って実施されました。 2010/63/EU、スウェーデン現地指令 No. L150/SJVFS/2019:9、Saknr no. 実験動物の調達と使用に関する L150 およびカロリンスカ研究所の補足ガイドライン、no. Dnr. 1937/03-640。 記載されているすべての手順は、スウェーデンの実験動物の倫理実験に関する地方委員会によって承認されました (ストックホルムの Norra Djurförsöksetiska nämnd、番号 1995/2019 および 7029/2020)。

人間の脳組織は、コロンビア大学ニューヨーク州精神医学研究所の脳コレクションから入手されました。このコレクションには、マケドニア共和国からの脳サンプルも含まれています。 脳組織の採取は、ニューヨーク州精神医学研究所の施設内審査委員会の承認を得て行われ、脳の提供と心理解剖面接への参加に同意した近親者からインフォームド・コンセントを得た。

私たちは、精神医学的または神経学的診断を受けていない31歳の白人男性の脳海馬組織を分析しました。この男性は外傷性事故で死亡し、全体的評価スケール51スコアで測定される死亡前に高いレベルの全体的機能を持っていました。 90 (スコア 1 ～ 100、100 が最も高い機能)、向精神薬および麻薬に対して毒物学的陰性。 死後間隔（死亡から脳採取までの時間）は6.5時間であった。

前海馬領域は、右脳半球の新鮮凍結冠状切片 (厚さ 20 mm) から切り取られました。 海馬前部の歯状回領域（約 10 × 10 mm2）を選択しました。 10μmの凍結切片を、ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドガラス(番号63478-AS、電子顕微鏡科学社)上に収集した。 サンプルはさらに使用するまで -80 °C で保存されました。

アンロードされた Tn5 トランスポザーゼ (番号 C01070010) および pA-Tn5 (番号 C01070002) を Diagenode から購入し、製造業者のガイドラインに従ってトランスポソームを組み立てました。 トランスポソームアセンブリに適用されたオリゴは次のとおりです。

Tn5ME-A、5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'、

Tn5MErev、5'-/5Phos/CTGTCTCTTATACACATCT-3' および

Tn5ME-B、5'-/5Phos/CATCGGCGTACGACTAGATGTGTATAAGAGACAG-3'

PCR およびライブラリー構築に使用される DNA オリゴを補足表 4 に示します。すべての DNA バーコード配列は補足表 5 および 6 に、他のすべての化学物質および試薬は補足表 7 に示します。

Chrome フォトマスクは、Front Range Photomasks から購入し、チャネル幅は 20 または 50 μm でした。 ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体デバイスのモールドは、標準的なフォトリソグラフィーを使用して製造されました。 製造業者のガイドラインに従って、ＳＵ−８ネガフォトレジスト（番号ＳＵ−２０２５およびＳＵ−２０１０、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）をシリコンウェーハ（番号Ｃ０４００４、ＷａｆｅｒＰｒｏ）上にスピンコートした。 フィーチャの高さは、幅が 20 μm のデバイスでは約 20 μm、幅が 50 μm のデバイスではそれぞれ約 50 μm でした。 PDMS マイクロ流体デバイスは、SU-8 金型を使用して製造されました。 硬化剤と主剤を1:10の比率で混合し、混合物を型に注ぎました。 30分間脱気した後、混合物を70℃で2時間硬化させた。 固化した PDMS はさらに使用するために抽出されました。 我々は、PDMS デバイスの製造と準備のための詳細なプロトコルを公開しました 52。

凍結組織スライドを室温で 10 分間解凍しました。 組織をホルムアルデヒド (0.2%、0.05 U μl-1 RNase Inhibitor を含む) で 5 分間固定し、1.25 M グリシンでさらに 5 分間クエンチしました。 固定後、組織を1mlの0.5×DPBS-RIで2回洗浄し、脱イオン(DI)H2Oで洗浄した。

組織透過処理は、200μlの溶解緩衝液（3 mM MgCl2、0.01% Tween-20、10 mM Tris-HCl pH 7.4、0.01% NP40、10 mM NaCl、1% ウシ血清アルブミン（BSA）、0.001% ジギトニン）を用いて実施した。 、0.05 U μl – 1 RNase阻害剤）で15分間洗浄し、200μlの洗浄バッファー（10 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、1％ BSA、0.1％ Tween-20）で5分間2回洗浄しました。分。 転位ミックス (自家製トランスポソーム 5 μl、1× DPBS 33 μl、2× タグメンテーション バッファー 50 μl、1% ジギトニン 1 μl、10% Tween-20 1 μl、0.05 U μl-1 RNase Inhibitor、 10μlのヌクレアーゼフリーH2O)を加え、37℃で30分間インキュベートした。 次に、0.05 U μl-1 RNase 阻害剤を含む 200 μl の 40 mM EDTA を加え、室温で 5 分間インキュベートして、転移を停止しました。 最後に、組織切片を２００μｌの０．５×ＰＢＳ－ＲＩで５分間２回洗浄し、脱イオン水で洗浄した。

RTには、以下の混合物を使用しました:12.5μlの5×RT緩衝液、4.5μlのRNaseフリー水、0.4μlのRNase阻害剤、0.8μlのSuperase In RNase阻害剤、3.1μlの10mMデオキシヌクレオチド三リン酸、それぞれ6.2μl Maxima H Minus 逆転写酵素、25μlの0.5×PBS-RIおよび10μlのRTプライマー。 組織を室温で 30 分間インキュベートし、次に湿ったボックス内で 42℃で 90 分間インキュベートしました。 RT反応後、組織を1×NEBuffer 3.1および1% RNase阻害剤で5分間洗浄した。

最初のバーコード (バーコード A) の in situ ライゲーションでは、最初の PDMS チップが対象の組織領域を覆いました。 アライメントの目的で、10 倍の対物レンズ (Thermo Fisher Scientific、EVOS FL Auto 顕微鏡番号 AMF7000、EVOS FL Auto 2 ソフトウェア リビジョン 2.0.2094.0) を使用して明視野画像を撮影しました。 PDMS デバイスと組織スライドは、自家製のアクリル クランプでしっかりと固定されました。 まずバーコード A をライゲーション リンカー 1、100 μM ライゲーション リンカー 10 μl、100 μM の各バーコード A 10 μl、および 2× アニーリング バッファー (20 mM Tris pH 7.5 ～ 8.0、100 mM NaCl、2 mM EDTA) でアニーリングしました。 ）をよく混ぜます。 各チャンネルについて、2μlのライゲーションミックス（27μlのT4 DNAリガーゼバッファー、72.4μlのRNaseフリー水、5.4μlの5% Triton X-100、11μlのT4 DNA）を用いて5μlのライゲーションマスター混合物を調製しました。リガーゼ）、2μlの1×NEBuffer 3.1、および1μlの各アニールしたDNAバーコードA（A1-A50/A100、25μM）。 真空を使用してライゲーションマスター混合物をデバイスの 50 チャネルにロードし、続いてウェットボックス内で 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 1×NEBuffer 3.1で5分間洗浄した後、PDMSチップとクランプを取り外した。 スライドを水で洗浄し、空気中で乾燥させた。

2 番目のバーコード (バーコード B) の in situ ライゲーションでは、2 番目の PDMS チップをスライドに覆い、さらに 10 倍の対物レンズで明視野画像を撮影しました。 アクリルクランプを適用して、PDMS と組織スライドを一緒にクランプしました。 バーコード B (B1-B50/B100、25 μM) のアニーリングとライゲーションマスターミックスの調製は、バーコード A と同様に実行されました。デバイスはウェットボックス内で 37 °C で 30 分間インキュベートされました。 ＲＮａｓｅ阻害剤中のＳＵＰＥＲａｓｅを含む１×ＤＰＢＳで５分間洗浄した後、ＰＤＭＳチップおよびクランプを取り外した。 スライドを水で洗浄し、空気中で乾燥させた。 次に、さらなる位置合わせのために明視野画像が撮影されました。

組織溶解の場合、対象領域を 100 μl の逆架橋混合物 (0.4 mg ml-1 プロテイナーゼ K、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、1% SDS) で 58 °C で消化しました。湿った箱の中で2時間。 溶解物を 1.5 m チューブに収集し、65 °C で一晩インキュベートしました。

DNA と cDNA を分離するために、ライセートを Zymo DNA Clean & Concentrator-5 で精製し、100 μl の RNase フリー水に溶出しました。 0.05% Tween-20を含む1×B&W緩衝液を使用して、40μlのDynabeads MyOne Streptavidin C1ビーズを3回洗浄した。 次に、2.5μlのSUPERase In RNase阻害剤を含む100μlの2×B&W緩衝液を使用してビーズを再懸濁し、次いで溶解物と混合し、撹拌しながら室温で1時間結合させた。 磁石を使用して、溶解物中のビーズと上清を分離しました。

ATAC ライブラリ構築のために上清を除去し、Zymo DNA Clean & Concentrator-5 で精製し、20 μl の RNase フリー水に溶出しました。 PCR溶液（25μlの2×NEBNext Master Mix、2.5μlの25μMインデックス付きi7プライマー、2.5μlの25μM P5 PCRプライマー）を添加し、よく混合した。 最初に以下のプログラムで PCR を実行しました:72 °C で 5 分間、98 °C で 30 秒、98 °C で 10 秒、63 °C で 30 秒、および 72 °C で 1 分間のサイクルを 5 回繰り返しました。 追加のサイクルを決定するために、事前に増幅した混合物 (5 μl) を定量的 PCR (qPCR) 溶液 (2× NEBNext Master Mix 5 μl、25× SYBR Green 0.24 μl、25 μM 新しい P5 PCR プライマー 0.5 μl) と混合しました。 、3.76μlのヌクレアーゼフリーH2O、0.5μlの25μMインデックス付きi7プライマー）。 次に、以下のプログラムで qPCR 反応を実行しました: 98 °C で 30 秒、98 °C で 10 秒、63 °C で 30 秒、および 72 °C で 1 分間のサイクルを 20 回繰り返しました。 残りの事前増幅されたDNA (45 μl) は、qPCR によって決定されるように追加のサイクルを実行することによって増幅されました (飽和シグナルの 3 分の 1 に達するまで)。 最終PCR産物を1×Ampure XPビーズ(45μl)で精製し、ヌクレアーゼフリーH2O 20μlで溶出した。

ビーズは、cDNA ライブラリーの構築に使用されました。 まずそれらを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１×Ｂ＆Ｗ緩衝液４００μｌで２回、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で１回洗浄した。 cDNA分子が結合したストレプトアビジンビーズをTSO溶液(各22μlの10mMデオキシヌクレオチド三リン酸、44μlの5×Maxima RT緩衝液、44μlの20%Ficoll PM-400溶液、88μlのRNaseフリー水、 5.5μlの100uMテンプレートスイッチプライマー(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrG+G)、11μlのMaxima H Minus Reverse Transcriptase、5.5μlのRNase阻害剤)。 ビーズを室温で 30 分間、次に 42 °C で 90 分間、穏やかに振盪しながらインキュベートしました。 ビーズを400μlの10 mM Trisおよび0.1% Tween-20で1回、水で1回洗浄した後、PCR溶液(110μlの2×Kapa HiFi HotStart Master Mix、8.8μlの10μMプライマー1および2)に再懸濁した。 、92.4μlのRNaseフリー水）。 PCR サーモサイクリングは、次のプログラムを使用して実行しました: 95 °C で 3 分間、98 °C で 20 秒、65 °C で 45 秒、および 72 °C で 3 分間のサイクルを 5 回繰り返しました。 5サイクル後、PCR溶液からビーズを除去し、25×SYBR Greenを1×濃度で加えた。 サンプルを再度、以下の熱サイクル条件で qPCR 装置に置きました: 95 °C で 3 分間、98 °C で 20 秒間のサイクル、65 °C で 20 秒間および 72 °C で 3 分間のサイクルを 15 回、その後 5 回72℃で最低。 qPCRシグナルがプラトーになり始めたら、反応を除去した。 PCR産物を0.8×Ampure XPビーズで精製し、20μlのヌクレアーゼフリーH2Oで溶出した。

Nextera XT Library Prep Kit をライブラリーの調製に使用しました。 精製 cDNA (1 ng) を RNase フリー水で総量 5 μl に希釈し、10 μl のタグメント DNA バッファーと 5 μl のアンプリコンタグメントミックスを加えて、55 °C で 5 分間インキュベートしました。 次いで、５μｌのＮＴ緩衝液を添加し、室温で５分間インキュベートした。 PCRマスター溶液（15μlのPCRマスターミックス、1μlの10μM P5プライマー、1μlの10μMインデックスP7プライマー、8μlのRNaseフリー水）を添加し、以下のプログラムでPCR反応を実施した：95° Cで30秒間、95℃で10秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間、および72℃で5分間を12サイクル。 PCR産物を0.7×Ampure XPビーズで精製してライブラリーを得た。

Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip を使用して、シーケンス前にライブラリーのサイズ分布と濃度を決定しました。 NGS は Illumina NovaSeq 6000 シーケンサー (ペアエンド、150 塩基対モード) で実施されました。

凍結組織スライドを室温で 10 分間解凍しました。 組織をホルムアルデヒド (0.2%、0.05 U μl-1 RNase 阻害剤を含む) で 5 分間固定し、1.25 M グリシンでさらに 5 分間クエンチしました。 固定後、組織を１ｍｌの洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル、０．５ｍＭ スペルミジン）で２回洗浄し、脱イオン水に浸漬した。 組織切片をNP40-ジギトニン洗浄緩衝液(洗浄緩衝液中0.01%のジギトニン、0.01%のNP40)で5分間透過処理した。 一次抗体 (抗体バッファー (NP40-ジギトニン洗浄バッファー中 0.001% BSA、2 mM EDTA) で 1:50 希釈) を加え、4 °C で一晩インキュベートしました。二次抗体 (モルモット抗ウサギ IgG、1:50) NP40-ジギトニン洗浄緩衝液で希釈したもの）を添加し、室温で30分間インキュベートした後、組織を洗浄緩衝液で5分間洗浄した 300洗浄緩衝液でpA-Tn5アダプター複合体を1:100に希釈したもの（1錠）のプロテアーゼ阻害剤カクテル、300 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、20 mM HEPES pH 7.5）を加えて室温で 1 時間インキュベートし、続いて 300 洗浄バッファーで 5 分間洗浄しました。 -洗浄バッファー) を 37 °C で 1 時間インキュベートしながら添加しました。次に、0.05 U μl-1 RNase 阻害剤を含む 40 mM EDTA を添加し、室温で 5 分間インキュベートしてタグメンテーションを停止しました。組織を 0.5x で 2 回洗浄しました。さらに使用する場合は、DPBS-RI を 5 分間処理します。

RT、2 回のライゲーション、およびビーズ分離のプロトコールは空間 ATAC-RNA-seq と同様でした。 CUT&Tag ライブラリーを構築するために、上清を Zymo DNA Clean & Concentrator-5 で精製し、20 μl の RNase フリー水に溶出しました。 PCR溶液(10μM P5 PCRプライマーおよびインデックス付きi7プライマーをそれぞれ2μl、NEBNext Master Mixを25μl)を添加し、よく混合した。 PCR は以下のプログラムで実施しました: 58 °C で 5 分間、72 °C で 5 分間、98 °C で 30 秒間インキュベートし、その後 98 °C で 10 秒間サイクルし、60 °C で 10 秒間インキュベートします。最後に 72 °C で 1 分間インキュベートします。 PCR産物を標準プロトコールを使用して1.3×Ampure XPビーズで精製し、20μlのヌクレアーゼフリーH2Oで溶出した。 cDNA ライブラリの構築は、空間 ATAC-RNA-seq プロトコルに従いました。

Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip を使用して、シーケンス前にライブラリーのサイズ分布と濃度を決定しました。 NGS は Illumina NovaSeq 6000 シーケンサー (ペアエンド、150 塩基対モード) で実施されました。

ATAC および CUT&Tag データの場合、リンカー 1 および 2 を使用してリード 2 をフィルターし、配列を Cell Ranger ATAC v.1.2 フォーマット (10X Genomics) に変換しました。 ゲノム配列は新しく形成されたリード 1 にあり、バーコード A および B は新しく形成されたリード 2 に含まれています。fastq ファイルの位置合わせにはヒト参照 (GRCh38) またはマウス参照 (GRCm38) が使用されました。 このようにして得られたBED様フラグメントを使用して下流分析を実施した。 フラグメント ファイルには、空間的位置情報 (バーコード A × バーコード B) とゲノムのフラグメントが含まれます。

RNA データの場合、リード 2 はバーコード A、バーコード B、および UMI を抽出するために改良されました。 ST パイプライン v.1.7.2 (参考文献 53) を使用して、処理されたリード 1 をマウス ゲノム (GRCm38) またはヒト ゲノム (GRCh38) に対してマッピングし、遺伝子と空間的位置に関する情報を含む下流解析用の遺伝子マトリックスを作成しました。 (バーコードA × バーコードB)。

まず、MATLAB 2020b (https://github.com/edicliuyang/Hiplex_proteome) を使用して、明視野画像から組織上のピクセルの位置を特定しました。

Signac v.1.8 (ref. 54) が R v.4.1 にロードされました。 ATAC、CUT&Tag、および RNA マトリックスは Signac v.1.8 に読み込まれました (参考文献 54)。 RNA アッセイには「DefaultAssay」機能を使用しました。 RNA データ視覚化の場合、「FindVariableFeature」関数を使用して特徴量を 3,000 に設定し、「SCTransform」関数を使用してデータを正規化しました。 正規化された RNA データがクラスター化され、RNA UMAP が構築されました。 DefaultAssay 機能を ATAC/CUT&Tag アッセイに適用しました。 ATAC/CUT&Tag データ視覚化の場合、最小カットオフは「FindTopFeature」関数で設定されました。 データは潜在的なセマンティック インデックスを使用して正規化および次元削減され、その後 ATAC/CUT&Tag データがクラスタリングされ、ATAC/CUT&Tag UMAP が構築されました。

DefaultAssay 機能は、ATAC/CUT&Tag および RNA アッセイの統合に使用されました。 結合 ATAC/CUT&Tag および RNA データ 55 の視覚化には、「FindMultiModalNeighbors」機能が使用されました。 リダクション リストは ('pca', 'lsi') に設定され、ディメンション リストは RNA および ATAC/CUT&Tag のリストに設定され、モダリティの Weight.name は RNA の重みに設定され、結合 UMAP が構築されました。

上記で生成された UMAP をまとめてプロットするために、DefaultAssay を RNA に設定し、ATAC/CUT&Tag、RNA、または結合 ATAC/CUT&Tag と RNA の UMAP を「DimPlot」を使用して個別に視覚化しました。

RNA空間データの可視化に関しては、RNAから得られた遺伝子行列をSeurat v.4.1（参考文献56）にSeuratオブジェクトとしてロードし、Signacから得たRNAメタデータをSeuratオブジェクトに読み込んだ。 すべての空間マップは、「SpatialPlot」関数を使用してプロットされました。

ATAC/CUT&Tag 空間データ可視化に関しては、ATAC/CUT&Tag から取得したフラグメント ファイルを ArchRProject として ArchR v.1.0.1 (ref. 13) に読み込み、Signac から取得した ATAC/CUT&Tag メタデータを ArchRProject に読み込みました。 ArchRProject からのデータは、反復的な潜在セマンティック インデックス作成を使用して正規化され、次元が削減されました。 GAS と CSS の計算には、ArchR の Gene Score モデルを使用しました。 下流分析のために遺伝子スコア行列が得られました。 各クラスターのマーカー遺伝子/領域を見つけるには、ArchR の 'getMarkerFeature' および 'getMarkers' 関数 (testMethod = "Wilcoxon"、cutOff = "FDR <= 0.05"、groupBy = "seurat_cluster") を使用しました。 空間データを視覚化するために、ArchR から得られた結果を Seurat v.4.1 に入力して、データを組織にマッピングし直しました。 視覚化を改善するために、スーラ パッケージの「pt.size.factor」パラメーターを使用してピクセル サイズがスケーリングされました。

ピークと遺伝子のリンクについては、ArchR の「addGeneIntegrationMatrix」関数を使用して RNA Seurat オブジェクトを入力し、「addPeak2GeneLinks」関数でピークと遺伝子のリンクを描画しました。 ピークの同時アクセス可能性は、ArchR の「addCoAccessibility」関数を使用して計算されました。

Seurat v.4.1 (参考文献 56) は、RNA データの統合と細胞型の同定、および空間 RNA および scRNA-seq データを正規化するための「SCTransform」機能に使用されました。 2 つのデータセットに共通する特徴を取得するために、「SelectIntegration features」関数が使用されました。 「FindIntegrationAnchors」関数はアンカーを検索するために適用され、「IntegrateData」関数は特定されたアンカーを通じて統合データセットを作成するために適用されました。 取得された統合データセットはクラスター化されており、空間 RNA と scRNA-seq データの間で良好な一致が示されています。 「FindTransferAnchors」関数を使用して転送アンカーを検索し、その後、「TransferData」関数でラベル転送を実行するために使用しました (1 つのピクセルに複数のセル タイプが表示された場合は、主要なセル タイプが割り当てられました)。

Signac v.1.8 および Seurat v.4.1 は、ATAC/CUT&Tag および scATAC-seq/scCUT&Tag データの統合に使用されました。 scATAC-seq/scCUT&Tag データは、ATAC/CUT&Tag データに従って定量化され、両方のデータセットに共通の特徴があることを確認しました。 FindIntegrationAnchors 関数 (reduction = "rlsi") を使用して、2 つのデータセット間のアンカーを特定しました。 「IntegrateEmbeddings」関数を使用して、識別されたアンカーを通じて統合データセットを取得しました。 取得された統合データセットはクラスター化されており、空間 ATAC/CUT&Tag データと scATAC-seq/scCUT&Tag データの間で良好な一致が示されています。 ATAC データの場合、FindTransferAnchors 関数を使用して転送アンカーを見つけ、その後、「MapQuery」関数を使用して scATAC-seq を空間 ATAC データにマッピングするために使用しました。

ArchR v.1.0.1 は、scRNA-seq データからの ATAC/CUT&Tag データの細胞型識別に使用されました。 ATAC/CUT&Tag の遺伝子スコア マトリックスを scRNA-seq の遺伝子発現マトリックスと比較し、ATAC/CUT&Tag データのピクセルを scRNA-seq の細胞と位置合わせしました。 関数「GeneIntegrationMatrix」を使用して、擬似 scRNA 配列プロファイルと細胞 ID を追加しました。

相関分析は、さまざまな組織領域に対して実行されました。 マウスの脳半球は、RNAクラスターと解剖学的注釈に従って7つのクラスター（脳梁、線条体、表皮質層、深層皮質層、側脳室、側中隔核など）に分離され、「tissue_clusters」と名付けられました。 図4a〜cでは、「FindMarkers」関数（設定：min.pct = 0.25、logfc.threshold = 0.25）を使用してRNAデータを計算し、調整されたP < 10−5の遺伝子がマーカー遺伝子として選択されました。 getMarkerFeature 関数 (設定: groupBy = "tissue_clusters") を適用して、マーカー遺伝子リスト (cutOff = "FDR <= 0.05" & (cutOff = "Log2FC >= 0.1" または CutOff = ") から遺伝子の GAS または CSS を計算しました。 Log2FC <= −0.1"))。 特定の遺伝子の avg_log2FC > 0 (RNA) および Log2FC > 0 (CUT&Tag) の場合、象限 I に表示されます。GO エンリッチメント分析は、clusterProfiler v.4.2 パッケージの「enrichGO」機能 (qvalueCutoff = 0.05) を使用して実行されました25。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この論文で報告された生​​のデータと処理されたデータは、アクセッション コード GSE205055 で Gene Expression Omnibus に保管されています。 これらのデータセットは Web リソースとして利用でき、UCSC Cell and Genome Browser (https://brain-spatial-omics.cells.ucsc.edu) および AtlasXplore で生成された独自のデータ ポータルの組織空間座標内で閲覧できます。 (https://web.atlasxomics.com/visualization/Fan)。 データは https://ki.se/en/mbb/oligointernode でも入手できます。 結果として得られた fastq ファイルは、ヒト参照ゲノム (GRCh38) (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/chromosomes/) またはマウス参照ゲノム (GRCm38) (https://hgdownload.soe) のいずれかにアライメントされました。 .ucsc.edu/goldenPath/mm10/chromosomes/)。 統合および品質比較用の公開データはオンラインで入手できます: ENCODE ATAC-seq (E13.5 マウス胚) (https://www.encodeproject.org/search/?type=Experiment&status=releases&popular_series.@type=OrganismDevelopmentSeries&replicates.library.biosample) .organism.scientific_name=Mus+musculus&assay_title=ATAC-seq&life_stage_age=embryonic%2013.5%20days); ENCODE RNA-seq (E13.5 マウス胚): 前脳 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78493); 中脳 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78456); 後脳 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78481); マウス器官形成細胞アトラス (https://oncoscape.v3.sttrcancer.org/atlas.gs.washington.edu.mouse.rna/downloads)。 成体マウスの大脳における遺伝子調節要素のアトラス (http://catlas.org/mousebrain/#!/downloads)。 思春期マウスの脳のアトラス (http://mousebrain.org/adolescent/downloads.html)。 マウス脳 scCUT&Tag H3K27ac データ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949207); マウス脳 scCUT&Tag H3K27me3 データ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949205); マウス脳 scCUT&Tag H3K4me3 データ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163532); ヒト海馬 (snRNA-seq) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE186538)、およびヒト海馬 (scATAC-seq) (https://www.ncbi .nlm.nih.gov/geo/query/a cc.cgi?acc=GSE147672). ソース データはこの文書とともに提供されます。

シーケンス データ分析のコードは、Github (https://github.com/di-0579/Spatial_epigenome-transcriptome_co-sequencing) で入手でき、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7395313) にアーカイブされています。

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リファレンスをダウンロードする

リサーチ コンピューティング インフラストラクチャの指導と使用については、イェール大学リサーチ コンピューティング センターに感謝します。 マイクロ流体デバイスのモールドは、イェール大学工学部および応用科学ナノファブリケーション センターで製造されました。 NGS は、コネチカット再生医療研究基金と李嘉誠財団の支援を受けて、エール大学ゲノム解析センターとエール大学幹細胞センターのゲノミクス中核施設で実施されました。 Yale Cooperative Center of Excellence in Hematology の Genomics Core によって提供されるサービス (番号 U54DK106857) が使用されました。 実験動物倫理許可書を作成し、動物実験を支援してくれた T. Jimenez-Beristain と、Comparative Medicine-Biomedicum のスタッフに感謝します。 M. Bartosovic は、Vinnova Seal of Excellence Marie-Sklodowska Curie Actions の希突起膠細胞系統発生に関する RNA 中心の見解 (RODent) から資金提供を受けました。 EA は、欧州連合、Horizo​​n 2020、Marie-Sklodowska Curie Actions、助成金 SOLO (no. 794689) から資金提供を受けました。 GC-B. の研究グループの研究は、スウェーデン研究評議会 (助成金番号 2019-01360)、スウェーデン癌協会 (Cancerfonden、番号 190394 Pj)、クヌートおよびアリス ワレンバーグ財団 (助成金番号 2019) の支援を受けました。 -0107 および 2019-0089)、スウェーデン医学研究協会 (助成金番号 JUB2019)、自然科学および医学研究のためのゴラン グスタフソン財団、ミン ワイ ラウ修復医学センター、およびカロリンスカ研究所。 この研究は、パッカード科学工学フェローシップ (RF 宛)、エール幹細胞センター チェン イノベーション賞 (RF 宛)、および米国国立衛生研究所 (番号 RF1MH128876、U54AG076043、U54AG079759、UG3CA257393、UH3CA257393、R01CA245313 および U54CA274) の支援を受けました。 509 RFに）。 YL はがん免疫療法協会フェローシップの支援を受けました。

カロリンスカ研究所が提供するオープンアクセス資金。

鄧延祥

現在の住所: ペンシルバニア大学ペレルマン医科大学エピジェネティクス研究所病理学および検査医学部門、米国ペンシルベニア州フィラデルフィア

これらの著者は同様に貢献しました: Di Zhang、Yanxiang Deng

米国コネチカット州ニューヘブンのイェール大学生物医工学部

Di Zhang、Yanxiang Deng、Graham Su、Shuozhen Bao、Yang Liu、Rong Fan

米国コネチカット州ニューヘブンのエール大学医学部、エール幹細胞センターおよびエールがんセンター

Yanxiang Deng、Graham Su、Yang Liu、Rong Fan

スウェーデン、ストックホルム、カロリンスカ研究所、医生化学および生物物理学科、分子神経生物学研究室

ペトラ・クカンジャ、エネリッツ・アギレ、マレク・バルトソビッチ、ゴンサロ・カステロ＝ブランコ

米国コネチカット州ニューヘブンのイェール大学医学部病理学教室

ミンゼ・ドン、ユヴァル・クルーガー、ロン・ファン

米国コネチカット州ニューヘブンのイェール大学、計算生物学および生物情報学における学部間プログラム

ミンゼ・ドン & ユヴァル・クルーガー

プリンストン大学コンピューターサイエンス学部、プリンストン、ニュージャージー州、米国

コン・マー & ベンジャミン・J・ラファエル

Klarman Cell Observatory、MIT およびハーバード大学ブロード研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

サイマ

コロンビア大学生物医工学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

ヤン・シャオ＆カム・W・レオン

コロンビア大学精神科、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

ゴラズド・B・ロソクリヤ、アンドリュー・J・ドワーク、J・ジョン・マン、モーラ・ボルドリーニ

米国ニューヨーク州ニューヨーク州精神医学研究所、分子イメージングおよび神経病理学部門

ゴラズド・B・ロソクリヤ、アンドリュー・J・ドワーク、J・ジョン・マン、モーラ・ボルドリーニ

マケドニア科学芸術アカデミー、マケドニア共和国、スコピエ

ゴラズド・B・ロソクリヤ & アンドリュー・J・ドワーク

コロンビア大学病理学・細胞生物学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

アンドリュー・J・ドワーク

コロンビア大学放射線学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

J・ジョン・マン

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学アービング医療センター、システム生物学部

カム・W・レオン

AtlasXomics, Inc.、米国コネチカット州ニューヘブン

リヤ・ワン

カリフォルニア大学サンタクルーズ校ゲノミクス研究所、米国カリフォルニア州サンタクルーズ

マクシミリアン・ホイスラー

応用数学プログラム、イェール大学、ニューヘブン、コネチカット州、米国

ユヴァル・クルーガー

ミン・ワイ・ラウ修復医学センター、カロリンスカ研究所、ストックホルム・ノード、ストックホルム、スウェーデン

ゴンサロ・カステロ・ブランコ

ヒトおよびトランスレーショナル免疫学プログラム、イェール大学医学部、米国コネチカット州ニューヘブン

ロン・ファン

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RF は研究を概念化しました。 DZ、YD、YL が方法論を担当しました。 DZとYDは実験調査を実施した。 DZ、YD、PK、EA、M.バルトソビッチ、MD、CM、SM、BJR、YK、GC-B。 とRFがデータ分析を担当しました。 PK、GS、SB、YX、KWL、GBR、AJD、JJM、および M. Boldrini がリソースの取得を担当しました。 LW と MH はデータ ブラウザーを担当しました。 DZ、YD、RF が原案を書きました。 著者全員が原稿をレビュー、編集、承認しました。

Yanxiang Deng、Gonçalo Castelo-Branco、または Rong Fan への通信。

RF、DZ、および YD は、この研究に関連する特許仮開示の発明者です。 RF は、IsoPlexis、Singleron Biotechnologies、AtlasXomics の科学創設者兼アドバイザーです。 RF の利益は、大学の利益相反ポリシーに従って、イェール大学学長室によって検討および管理されました。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Steven Henikoff、Erica Scott、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、spatial-ATAC-RNA-seq および spatial-CUT&Tag-RNA-seq の概略ワークフロー。 b – c、空間ATAC-RNA-seqにおけるATAC（b）とRNA（c）の化学ワークフロー。 d – e、空間 CUT&Tag-RNA-seq における CUT&Tag (d) および RNA (e) の化学ワークフロー。

a、E13 マウス胚の隣接組織切片からの H&E 画像。 b、GAS の空間マッピングと空間 ATAC-RNA 配列内の選択されたマーカー遺伝子の遺伝子発現。 c、E13.5 マウス胚からの scRNA 配列データ 12 と、空間 ATAC-RNA 配列における ATAC および RNA データの統合。 MOCA、マウス器官形成細胞アトラス。 d、scRNA-seq12からATAC（上）およびRNA（下）へのラベル転移によって同定された細胞型の空間マッピング。 e、遠位調節エレメントとピークの同時アクセス性のピークと遺伝子のリンクを含むマーカー遺伝子のゲノム追跡視覚化。 f、spatial-ATAC-RNA-seq の RNA データのすべてのクラスター (各クラスターのマーカー遺伝子) における発現レベルとピクセルのパーセンテージ。 g、正のTF調節因子の同定を示すドットプロット。 h、選択された TF モチーフの偏差スコアの空間マッピング。 i, 異なるクラスター内のマーカー ピークの注釈。 j、さまざまなクラスター内のマーカー ピークの優れた濃縮分析 (二項検定および超幾何検定)。

a、図1gの遺伝子のGO濃縮分析。 b、c、GAS (b) および遺伝子発現 (c) を使用した放射状グリアから有糸分裂後未熟ニューロンまでの擬時間解析。 d、(b) のさまざまな状態を示す Monocle2 分析。 e、擬似時間軌跡に沿ったさまざまな状態のヒートマップ。 f、(e)の赤いボックス内の遺伝子のGO分析（フィッシャーの直接確率検定の片側バージョン、p値はBenjamini & Hochberg法による多重比較のために調整されました）。

a、空間ATAC-RNA配列における選択されたマーカー遺伝子の遺伝子活性スコアと遺伝子発現の空間マッピング。 b. 遠位調節エレメントのピークと遺伝子のリンクおよびピークの同時アクセス性を備えたマーカー遺伝子のゲノム追跡視覚化。 c、scATAC-seq30からATACデータへのラベル転送によって特定された細胞型の空間マッピング。 IT: 大脳内性。 PT: 錐体路。 NP: ほぼ投影。 CT: 皮質視床。 L：レイヤー。 d、scRNA-seq32からRNAデータへのラベル転移によって同定された細胞型の空間マッピング。

a、Sox2、Pax6、およびMobpの候補TF規制者。 強調表示された点は、abs(規制スコア) ≥ 1 (-log10 スケール) 33 を持つ TF であり、他のすべての TF は灰色で示されます (Z テスト)。 b、選択されたTFモチーフの偏差スコアの空間マッピング。 c、空間ATAC-RNA-seqにおけるピークと遺伝子のリンクのヒートマップ。 d, 各遺伝子の有意に相関したピークの数。

a〜c、マウス脳の空間ATAC-RNA-seqにおけるATAC（a）、RNA（b）のすべてのクラスターの空間分布とUMAP、およびATACとRNAの共同クラスター化（c）。 ピクセルサイズ、20μm。 スケールバー、1 mm。 d、P21マウス脳の隣接組織切片からのニッスル染色画像。 スケールバー、1 mm。 e、空間ATAC-RNA-seqにおけるATACデータとマウス脳からのscATAC-seqデータ30の統合。 f、空間 ATAC-RNA-seq の RNA データとマウス脳の scRNA-seq データ 32 の統合。 g、空間ATAC-RNA配列におけるATACおよびRNAの異なるクラスターにおける選択されたマーカー遺伝子のGASおよび遺伝子発現の空間マッピング。

a、空間 CUT&Tag-RNA-seq における CUT&Tag (H3K4me3) データとマウス脳からの scCUT&Tag (H3K4me3) データ 36 の統合。 b、spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq、spatial-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq、およびspatial-CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seqにおけるRNAデータと、マウス脳からのscRNA-seqデータ32の統合。 ce、spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq の RNA データの統合 (c)、spatial-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq のデータの RNA データ (d)、および spatial-CUT&Tag(H3K4me3) の RNA データの統合-RNA-seq (e) とマウス脳からの scRNA-seq データ 32。 f、scRNA-seq32からspatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seqのRNAデータへのラベル転移によって特定された細胞型の空間マッピング。 g、空間 CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq の scRNA-seq32 から RNA (上) および scRNA-seq32 から CUT&Tag (H3K27ac、下) データへのラベル転移によって特定された細胞型の空間マッピング。 h、空間 CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq の scRNA-seq32 から RNA (上) および scRNA-seq32 から CUT&Tag (H3K4me3、下) データへのラベル転移によって特定された細胞型の空間マッピング。

ac、マウス脳の空間 CUT&Tag-RNA-seq における CUT&Tag (H3K27ac) (a)、RNA (b) のすべてのクラスターの空間分布と UMAP、および CUT&Tag (H3K27ac) と RNA の共同クラスター化 (c)。 ピクセルサイズ、20μm。 スケールバー、1 mm。 d、P21マウス脳の隣接組織切片からのニッスル染色画像。 スケールバー、1 mm。 e、空間 CUT&Tag-RNA-seq における CUT&Tag (H3K27ac) データとマウス脳からの scCUT&Tag (H3K27ac) データ 37 の統合。 f、spatial-CUT&Tag-RNA-seq の RNA データとマウス脳の scRNA-seq データ 32 の統合。

ag、ATAC からの CSS、GAS、および Mal (a)、Mag (b)、Car2 (c)、Grin2b (d)、Syt1 (e)、Gpr88 (f)、および Ptprz1 (g) の遺伝子発現の空間マッピング空間 ATAC-RNA-seq の RNA、空間 CUT&Tag-RNA-seq の CUT&Tag (H3K27me3、H3K27ac、または H3K4me3) と RNA。 h、空間 CUT&Tag(H3K27me3)-RNA 配列における CSS と Nav3、Sncb、Ablim2、および Gng7 の遺伝子発現の空間マッピング。

a、ヒト海馬の空間ATAC-RNA-seq内のscRNA-seq43からRNAデータへのラベル転移によって同定された細胞型の空間マッピング。 b、正のTF調節因子の同定を示すドットプロット。 c、空間ATAC-RNA配列における選択されたTFモチーフの偏差スコアの空間マッピング。

補足図。 1 ～ 14、表 2 ～ 7、統計と再現性。

マウスの脳の細胞タイプの注釈のリスト。

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転載と許可

Zhang、D.、Deng、Y.、Kukanja、P. 他。 哺乳動物組織の空間エピゲノムとトランスクリプトームのコプロファイリング。 Nature 616、113–122 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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受信日: 2022 年 6 月 6 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 3 月 15 日

発行日: 2023 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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